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  1. 08-05-2013,  11:29 AM #1161 hchiphejeff hchiphejeff is offline Wild Hog Hunter Join Date May 2013 Posts 71,892 Blog Entries 63084

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  2. 08-05-2013,  11:30 AM #1162 hchiphejeff hchiphejeff is offline Wild Hog Hunter Join Date May 2013 Posts 71,892 Blog Entries 63084 Sign in
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    Gaetano Odierna » 3.Allestimento di preparati biologici in microscopia ottica ed elettronica


    Problematica per l’osservazione dei preparati biolgici

    L’osservazione al microscopio ottico o elettronico dei campioni biologici richiede che i preparati siano sufficientemente sottili da risultare trasparenti al fascio di luce o di elettroni e che sia preservata la morfologia delle cellule e degli organelli in esse contenuti.

    Tecnica delle fette

    In microscopia ottica il procedimento comunemente in uso per l’allestimento dei preparati è la “tecnica delle fette” di campioni inclusi in paraffina. La tecnica prevede i seguenti passaggi:

    1. prelievo organo;
    2. fissazione;
    3. lavaggio;
    4. disidratazione (tramite serie ascendente degli alcol);
    5. chiarificazione in solventi organici (xilene – Histolemon);
    6. inclusione in paraffina;
    7. sezioni al microtomo;
    8. distensione delle fette su vetrini;
    9. sparaffinatura in solventi organici;
    10. idratazione delle fette tramite la serie discendente degli alcool;
    11. colorazione;
    12. disidratazione tramite serie ascendente degli alcool;
    13. chiarificazione;
    14. montaggio in balsamo (resine sintetiche).

    Tecnica delle fette: prelievo e fissazione

    1 – Prelievo: il prelievo dell’organo, solitamente di dimensioni al di sotto del cm3, va eseguito rapidamente, e se necessario, iniettando il fissativo via perfusione.

    2 – Fissazione: ha lo scopo di bloccare la lisi delle cellule e dei tessuti e di preservarne il più possibile la struttura.


    Tecnica delle fette: fissazione e disidratazione


    Tecnica delle fette: inclusione in paraffina

    6 – Inclusione in paraffina: viene effettuata in paraffina liquida, mantenuta a 60° in apposite stufe dove, preferibilmente, è possibile effettuare il vuoto.

    Preparazione blocchetti: il campione è contenuto in paraffina liquida, contenuta in contenitori prestampati o in lamelle di rame. La paraffina è poi lasciata solidificare a temperatura ambiente per 24 ore.

    Lamelle di rame
    Blocchetti pronti per il taglio al microtomo

    Tecnica delle fette: sezioni al microtomo

    7 – Sezioni al microtomo Il Microtomo: è uno strumento che permette di ottenere fette del campione incluso in paraffina dello spessore di 3-10 μm.

    8 – Distensione delle fette su vetrini: si ottiene mettendo le fette sulla superficie dell’acqua portata ad una temperatura tra i 40-50 °C.

    Affettatura

    Affettatura


    Tecnica delle fette: colorazione e montaggio in balsamo

    9 – Sparaffinatura in solventi organici: elimina la paraffina dalle fette.

    10 – Serie discendente degli alcool e idratazione: viene effettuata gradualmente tramite passaggi in alcol a gradazione decrescente.

    11 – Colorazione: può essere dicromica (emallume -eosina; prima immagine) o tricromica (ad esempio tricromica di Mallory; seconda immagine).

    12 – Disidratazione: si effettuta tramite il passaggio dei vetrini nella serie ascendente degli alcool.

    13 – Chiarificazione: si effettuata tramite il passaggio in solventi organici.

    14 – Montaggio in balsamo: consiste nell’interporre uno strato di resina sintetica tra vetrino porta- e coprioggetti.

    Colorazione dicromica (Emallume eosina)
    Colorazione tricromica di Mallory
    Colorazione

    Tecnica delle fette in Microscopia elettronica

    In linea di principio l’allestimento dei preparati biologici in microscopia elettronica segue gli stessi criteri della microscopia ottica. Tuttavia sono previsti importanti modifiche:

    • Prelievo: le dimensioni del campione sono di solito dell’ordine di 1-2 mm3. Il prelievo va effettuato a freddo in specifici tamponi.
    • Fissazione: è eseguita a freddo con fissativi chimici non coagulanti (es. paraformaldeide, gluteraldeide) a cui segue in genere la post-fissazione in tetrossido di osmio.
    • Inclusione: il campione viene incluso in plastica (resine epossidiche).
    • Sezioni: si usa l’ultramicrotomo con cui si possono ottenere sezioni ultrafini (80-100 nm). Si usano lame di vetro o di diamante montate su una bacinella con acqua. Le fette ottenute sono raccolte con un retino di rame.
    • Colorazione: si usano sali di metalli pesanti (opachi agli elettroni) ad esempio Sali di piombo, di platino, di oro, d’argento, etc.
    Sezioni con l’ultra-microtomo e raccolta delle fette con il retino di rame

    Sezioni con l'ultra-microtomo e raccolta delle fette con il retino di rame


    Schema della Tecnica delle fette in Microscopia elettronica

    Preparazione dei campioni per l’osservazione in microscopia elettronica. Fonte: G. Karp, Biologia Cellulare e Molecolare, Edises, II Ed. 2004

    Preparazione dei campioni per l'osservazione in microscopia elettronica. Fonte: G. Karp, Biologia Cellulare e Molecolare, Edises, II Ed. 2004


    Confronto tecniche delle fette in Microscopia ottica ed elettronica


    Particolari tecniche in uso in microscopia elettronica

    Colorazione negativa – viene applicata soprattutto per lo studio dei virus e delle macromolecole*.

    Il campione, sospeso in un colorante elettrondenso, è applicato su un retino ricoperto da un sottile film di plastica. Si asciuga all’aria e si osserva al TEM. Il colorante riempie gli spazi vuoti, che appariranno scuri, mentre i virus o le macromoleche risultano chiari.

    * le tecniche di isolamento e purificazione delle macromolecole (glucidi, lipidi, proteine e acidi nucleici) saranno discusse in specifici corsi, quali ad esempio Biochimica. Consultare anche i capitoli delle tecniche nei libri di testo consigliati dal docente del corso.

    Batteriofago evidenziato tramite colorazione negativa

    Batteriofago evidenziato tramite colorazione negativa


    Particolari tecniche in uso in microscopia elettronica II

    Ombreggiatura al platino – è usato per lo studio delle macromolecole.

    1) Il campione è adsorbito su un supporto liscio (lastra di mica). 2) Sotto vuoto spinto e sotto rotazione, sul campione viene proiettato, sotto un angolo di 5°-15°, un sottile strato di platino (elettron-denso) che evapora da un elettrodo al Platino reso incandescente. 3) Lo strato di platino, che rappresenta la replica della superficie del campione,  è stabilizzato da uno strato di carbone fatto cadere dall’alto da un elettrodo di  carbone (elettron-chiaro).  4) la replica di platino è prima trasferita in un bagno alcalino che degrada il campione e, quindi, dopo lavaggio, (5) è trasferita su un retino per l’osservazione al TEM (6).

    Molecole di miosina ombreggiate al platino

    Molecole di miosina ombreggiate al platino


    Particolari tecniche in uso in microscopia elettronica III

    Il freeze etching è una tecnica particolarmente usata per lo studio della struttura interna delle membrane cellulari e delle strutture cellulari interne. Il campione, opportunamente crioprotetto (1), è immerso in azoto liquido (2);  in tal modo l’acqua vetrifica. Il campione è immesso sotto vuoto e quindi è inciso da una lama (3). Il piano di frattura prezerenzialmente avviene lungo il doppio strato delle mambrane biologiche (4). La superficie esposta dalla frattura è poi ombreggiata al platino (5) e rinforzata da una strato di carbone. La sostanza organica del campione viene rimossa mediante digestione alcalina e la replica metallica dopo lavaggio è osservata al microscopio elettronico (6).


    Particolari tecniche – metodo di purificazione degli organelli cellulari


    Le lezioni del Corso

    1. Livelli di organizzazione in Biologia - Storia della citologia

    2. Principi e tecniche in microscopia

    3. Allestimento di preparati biologici in microscopia ottica ed elettronica

    4. Composizione chimica della cellula

    5. Principali metodi istochimicici, immuno-istochimici, colture in vitro, autoradiografia

    6. Sguardo d'insieme ai virus, alla cellula procariotica ed eucariotica

    7. La membrana plasmatica

    8. Fisiologia della membrana plasmatica

    9. Citoscheletro: generalità e i microfilamenti

    10. Citoscheletro: microtubuli e filamenti intermedi

    11. Giunzioni cellulari e adesione cellulare

    12. Ribosomi, smistamento proteine, reticolo endoplasmatico

    13. Apparato di Golgi, Lisosomi

    14. Esocitosi, Endocitosi, transcitosi

    15. Perossisomi, Mitocondri

    I materiali di supporto della lezione

    G. Karp - Biologia Cellulare e Molecolare – Edises – II Edizione 2004

    Esercitazioni

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